Hvordan lage Primers for PCR

Primers er en viktig komponent i forsterkningen av DNA begge deler in vivo og in vitro. In vivo, enzymet, DNA-polymerase krever en primer for initiering av DNA-replikasjon. In vitro, primere brukes mest for initiering av polymerasekjedereaksjon (PCR). Noen andre teknikker, inkludert sekvensering, kloning, stedrettet mutagenese etc. krever primere. Derfor utforming av primere for in vitro teknikker blir ganske enkle, men en utfordrende prosess for molekylærbiologer. Derfor diskuteres de grunnleggende reglene for primeren for både PCR og sekvensering i denne artikkelen.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er en Primer
- Definisjon, Typer, rolle
2. Hvordan fungerer primere i en PCR
- Egenskaper av DNA, Prosess av PCR
3. Hvordan lage Primers for PCR
- Grunnleggende regler for design av PCR-primere
4. Hvordan lage en Sequencing Primer
- Funksjoner av Sequencing Primers

Nøkkelbetingelser: DNA-syntese, fremoverprimere, lengde, smeltemetall, PCR, omvendt primere, sekvensering Primers

Hva er en Primer

En primer er en kort streng av DNA eller RNA som tjener som utgangspunkt for DNA-syntese. De enzymer som katalyserer DNA-replikasjon er i stand til å legge til nukleotider til en eksisterende 3'-ende. Derfor legger primer grunnlaget for DNA-syntese ved å tjene som en prime. RNA primere brukes inne i cellen for initiering av DNA-replikasjon med DNA-polymerase. Men syntetisk DNA-primere kan brukes til amplifisering av DNA, hovedsakelig ved PCR og andre teknikker. To typer primere brukes i PCR, og de er kjent som fremover og revers primere. Under PCR kan millioner av kopier av det ønskede DNA-fragment produseres ved å flankere den spesielle DNA-sekvensen i det genomiske DNA ved fremover- og revers-primere. Frem og tilbake primer som flanker en bestemt DNA-sekvens er vist i Figur 1.

Figur 1: Forward og Reverse Primers

Hvordan fungerer primere i PCR

DNA er et molekyl som har to tråder som holdes sammen. Baseparamønsteret er komplementært til hver i begge strengene. De to strengene holdes sammen av hydrogenbindingene mellom komplementære nitrogenbaser. I tillegg har hver streng egen retning. En streng har 5'to 3 'retningsretning, mens den andre har 3' til 5 'retning. Derfor er de to strengene antiparallelle. Strengen med 5 'til 3' retning er kjent som sansstrengen mens strengen med 3 'til 5' retning er kjent som antisensstrengen. Hver to tråder bør syntetiseres individuelt under PCR.

De tre trinnene med PCR er denaturering, glødning og forlengelse. Ved denaturering separeres de to strengene av DNA ved å bryte hydrogenbindingene ved oppvarming til 95 ° C. Forward primer binder seg til sansstrengen mens den bakre primer binder seg til antisensstrengen. Annealing av primere skjer når temperaturen faller fra 95 ° C til 50-60 ° C. Derfor kan begge trådene syntetiseres samtidig med hjelp av Taq polymerase. Amplifiseringen av både sans og antisense-strengene forekommer i 5'-til-3'-retningen. Siden PCR er en eksponensiell reaksjon, gjentas de tre trinnene i 25-35 sykluser. Både forover- og reversprimere brukes i hver syklus for å produsere rundt 2³⁵ kopier av ønsket DNA-fragment. Primerenes rolle i PCR er vist i figur 2.

Figur 2: PCR

Hvordan lage Primers for PCR

For å amplifisere et bestemt DNA-fragment i genomet, bør det spesielle DNA-fragment flankeres av både fremover- og revers-primere. Derfor bør begge primere være komplementære til sekvensene som flankerer DNA-fragmentet. De grunnleggende retningslinjene for den vellykkede utformingen av PCR-primere er beskrevet nedenfor.

Retningen for både forover og bakre primer skal være 5 'til 3'.
Lengden på hver primer bør være mellom 18 og 25 nukleotider i lengde.
GC-innholdet i primere er mellom 40 og 60% og tilstedeværelsen av en C eller G i 3'end av primeren kan fremme binding.
Smeltetemperaturen og Tm (temperaturen hvor halvparten av primeren har blitt utglødt til malen) av primerparet skal være lik og over 60 ° C. Maksimal forskjell bør være 5 ° C.
Den 3'-enden av primeren bør nøyaktig matche mal-DNA.
Minst 2G eller C baser (GC klemme) skal være til stede i de siste 5 basene ved 3'-enden av primeren. GC klemmen fremmer en sterk binding til målsekvensen.
Restriksjonsseter med 5-6 nukleotider kan legges til 5'enden av primeren.
Duinkleotidrepetatene (ATATATAT) eller gjentagelser av det samme nukleotid mer enn 4 ganger (ACCCC) bør unngås i primer-sekvensene. Dette fører til feilpriming.
Intra-primer homologi eller sekundære strukturer av primere bør unngås. Inter-primer-homologi eller komplementære sekvenser i frem- og revers-primere bør unngås. Begge forholdene kan danne selvdimere eller primerdimere.
ΔG-verdien for dimeranalyse bør være mellom 0 og -9 kcal / mol.

Mange elektroniske verktøy er tilgjengelige for enkelheten til primerdesignen som Primer 3, Primer X, NetPrimer, DNAstrar, etc. Specificiteten til de designede primere kan bestemmes av verktøyene som NCBI Primer-BLAST eller UCSC in-silico PCR.

Figur 3: Primer 3-grensesnitt

Hvordan lage en Sequencing Primer

Sequencing primere er korte, DNA-tråder, akkurat som PCR-primere. Imidlertid er PCR-primere konstruert for amplifisering av et bestemt DNA-fragment mens sekvenseringsprimere blir brukt til å avsløre nukleotidsekvensen av det amplifiserte DNA-fragment ved PCR. I motsetning til PCR-primere kan en enkelt primer brukes i sekvenseringen, hvis bare mål-sekvensen er mindre enn 500 bp i lengde. Som et eksempel kan den fremre primer av PCR brukes i sekvensering, for å amplifisere kun sansstrengen. Videre er graden av mismatcher tolerert under sekvenseringsreaksjonen høyere enn PCR. Generelt er PCR-primere komplementære til målsekvensen. Noen sekvenseringsprimere er imidlertid ikke relatert til målsekvensen. De er kjent som universelle primere. Universal primere som T7 eller SP6 anneal til vektoren som bærer målsekvensen. De kan brukes til både en rekke vektorer og ulike typer DNA-fragmenter.

Konklusjon

Primerer blir brukt i PCR og sekvensering for initiering av DNA-syntesen. To typer PCR-primere kan identifiseres som frem- og bakre primer. Forward primere anneal til sansstrengen mens revers primere anneal til antisense strengen. Ved sekvensering kan enten forover eller revers primer brukes til å forsterke målet. Under utformingen av primere bør mange faktorer vurderes som primer lengde, Tm og GC innhold. Mange elektroniske verktøy er tilgjengelige som kan brukes til utforming av primere for en bestemt sekvens.

Henvisning:

1. "Primer Design: Tips for en effektiv prosess." Genome Compiler Corporation, 3. november 2015, Tilgjengelig her.
2. "Sequencing primere og primer design." Sequencing primere og primer design, University of Calgary, Tilgjengelig her.

Bilde Courtesy:

1. "Primers RevComp" Av Zephyris - Eget arbeid (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Polymerase chain reaction" Av Enzoklop - Eget arbeid (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia

Vitenskap