Forskjellen mellom PCR og RT PCR

Hovedforskjell - PCR vs RT-PCR

PCR og RT-PCR er to viktige teknikker innen molekylærbiologi. PCR ble utviklet av Kary Mullis på 1980-tallet. Det er i stand til å øke antall kopier av et bestemt gen på en eksponentiell måte, for å lette deteksjonen av det bestemte DNA-fragment. Taq Polymerase er enzymet som oftest brukes i PCR-systemer. Det er et termostabilt enzym. I RT-PCR følges revers transkripsjon av PCR. Enzymet, revers transkriptase er involvert i syntese av komplementært DNA fra RNA. De hovedforskjell mellom PCR og RT-PCR er det PCR bruker dobbeltstrenget DNA som mal mens RT-PCR bruker RNA som mal.

Nøkkelområder dekket

1. Hva er PCR
      - Definisjon, Prosess, Søknad
2. Hva er RT PCR
      - Definisjon, egenskaper, søknad
3. Hva er forskjellen mellom PCR og RT PCR
      - Sammenligning av nøkkelforskjeller

Nøkkelbetingelser: PCR, RT-PCR, Polymerase Chain Reaction, Reverse Transkripsjon-Polymerase Chain Reaction, DNA Mal, DNA Polymerase, Denaturering, Annealing, Primer Extension

Hva er PCR

PCR (Polymerase kjedereaksjon) er en relativt enkel, men revolusjonær metode. PCR bruker enzymets evne, DNA-polymerase til å syntetisere nye DNA-strenge på en komplementær måte til den tilbudte templatstrengen. PCR er en uunnværlig teknikk som brukes i både kliniske og forskningslaboratorier for funksjonell analyse av gener, diagnose og overvåking av arvelige sykdommer, DNA-kloning, sekvensering og gammel DNA-amplifikasjon. DNA-mal, nukleotider, primere og DNA-polymerase er de fire hovedkomponentene av PCR. De DNA-mal er vanligvis et dobbeltstrenget DNA med målsekvensen som skal amplifiseres. Taq DNA-polymerase som er isolert fra Thermus akvatika brukes ofte i PCR. De pfu DNA-polymerase er en annen type DNA-polymerase med høy troskap. Både Taq og pfu polymeraser er varmebestandige. Nukleotidene tilsatt av DNA-polymeraser er adenin (A), guanin (G), cytosin (C) og tymin (T). Siden DNA-polymerase kun kan legge til et nytt nukleotid i en 3'-ende av en eksisterende DNA-streng, kreves en oligonukleotidprimer for initiering av DNA-syntese. Kravet til en primer i PCR tillater bare å definere en bestemt region i malen. Målsekvensen flankeres av forover- og revers-primere. På slutten av en PCR akkumuleres nye kopier kalt amplikoner av en bestemt DNA-sekvens i milliarder. Komponentene i PCR bør optimaliseres på en slik måte at PCR-ytelsen forbedres, samtidig som feilene reduseres.

PCR er en automatisert prosess utført av termisk syklusere, som er i stand til å bytte mellom forskjellige temperaturer. PCR er en tre-trinns prosess.

1. denaturering - Den dobbeltstrengede DNA-malen separeres i to enkle tråder ved oppvarming til 94-95 ° C.
2. annealing - Forover- og revers-primere binder seg til de komplementære sekvensene i malen. Temperaturen i dette trinnet avhenger av smeltetemperaturen til primerkombinasjonen.
3. Primer forlengelse - DNA-polymeraseenzym utvider hver av primrene ved deres 3'end ved å tilsette komplementære baser til den voksende streng. Den optimale temperaturen på Taq polymerase, 72 ° C brukes som temperaturen i forlengelsestrinnet. Tiden for forlengelsen avhenger av antall basepar i malstrengen.         

De tre trinnene gjentas i 28-35 ganger.

Figur 1: Polymerase Chain Reaction

Produktene fra PCR er størrelsesfraksjonert ved agarosegelelektroforese i sammenligning med en DNA-stige. Visualiseringen av DNA på en agarosegel utføres ved farging med etidiumbromid og observere under UV. De amplifiserte DNA-båndene under UV i en etidiumbromid-farget gel er vist i figur 2. DNA-stige er vist i venstre brønn.

Figur 2: DNA-bånd

Hva er RT-PCR

RT-PCR (Omvendt transkripsjon-polymerasekjedereaksjon) er en av de mest sensitive teknikkene som brukes til påvisning av mRNA. RNA er den passende mal for å samle informasjon enten på genuttrykket av et normalt vev eller genuttrykket av et infisert vev. Malen for RT-PCR kan enten være totalt RNA eller henholdsvis viralt eller bakterielt RNA. RNA er omvendt transkribert til komplementært DNA (cDNA) ved enzymet, revers transkriptase. Den optimale temperaturen på revers transkriptase er 46 ° C. CDNA brukes i PCR for å oppnå produktet. Trinn i omvendt transkripsjons-PCR er vist i figur 3.

Figur 3: RT-PCR

RT-PCR kan utføres i en to-trinns eller en-trinns reaksjon. I to-trinns reaksjonen utføres revers transkripsjon og PCR i to separate trinn. I en-trinns RT-PCR etterfølges revers transkripsjon av PCR i et enkelt rør på en sekvensiell måte. Både cDNA og det endelige PCR-produktet kan kjøres på en agarosegel for størrelsesfraksjonering og visualiseringsformål. En-trinns og to-trinns RT-PCR er vist i figur 4.

Figur 4: En-trinns og to-trinns RT-PCR

Forskjellen mellom PCR og RT-PCR

Definisjon

PCR: PCR er en teknikk som brukes i molekylærbiologi for å amplifisere et segment av DNA som genererer millioner av kopier av en DNA-sekvens.

RT-PCR: RT-PCR er en variant av PCR som brukes i påvisning av genuttrykk i molekylærbiologi.

Steps

PCR: Denaturering, annealing og forlengelse er de tre trinnene i PCR.

RT-PCR: I RT-PCR følges revers transkripsjon av PCR. 

Mal

PCR: Et dobbeltstrenget DNA-molekyl tjener som mal for PCR.

RT-PCR: Et enkeltstrenget RNA-molekyl tjener som mal for revers transkripsjon. Et enkeltstrenget DNA-molekyl tjener som mal for PCR.

Enzymer brukt

PCR: DNA-polymerase brukes som enzymet i PCR.

RT-PCR: Omvendt transkriptase og DNA-polymerase brukes som enzymer i RT-PCR.

primere

PCR: Frem og tilbake primere brukes i PCR.

RT-PCR: Bare revers-primer brukes til revers transkripsjon, og både fremover- og revers-primere brukes i PCR.

Følsomhet

PCR: PCR er en sensitiv metode.

RT-PCR: RT-PCR er mer følsom som PCR.

applikasjoner

PCR: PCR brukes i funksjonell analyse av gener, diagnose og overvåking av arvelige sykdommer, DNA-kloning, DNA-sekvensering og gammel DNA-amplifikasjon.

RT-PCR: RT-PCR brukes i deteksjon av genuttrykk.

Konklusjon

PCR og RT-PCR er to viktige teknikker som brukes i molekylærbiologi. Både PCR og RT-PCR er automatiserte teknikker som er i stand til å øke eksponentielt antall kopier av en mål-DNA-sekvens, som er definert av fremover- og revers-primere. I PCR brukes dobbeltstrenget DNA som mal. Ved PCR kan DNA-kloning, DNA-sekvensering og funksjonell analyse av genene gjøres. I RT-PCR kan genuttrykk i et bestemt vev bli observert ved å amplifisere RNA. Hovedforskjellen mellom PCR og RT-PCR er i deres maler som brukes i hver reaksjon og deres anvendelser.   

Henvisning:

1. "Polymerase Chain Reaction (PCR)." National Center for Biotechnology Information. U.S. National Library of Medicine, n.d. Web. Tilgjengelig her. 1. juni 2017.
2. "Polymerase Chain Reaction (eller PCR)." Kloning og molekylær analyse av gener. N.p., n.d. Web. Tilgjengelig her. 1. juni 2017. 
3. Biolabs, New England. "CDNA Synthesis & RT-PCR." CDNA Syntese & RT-PCR | NEB. N.p., n.d. Web. Tilgjengelig her. 1. juni 2017.

Bilde Courtesy:

1. "Polymerase chain reaction" Av Enzoklop - Eget arbeid (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis." Av Rainis Venta - Eget arbeid (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. "Omvendt transkripsjonspolymerasekjedereaksjon" Av Jpark623 - Eget arbeid (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
4. "Ett-trinns vs to-trinns RT-PCR" Av Jpark623 - Eget arbeid (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia